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一、 样品前处理方法
2g鸡肉,加入15mL水,涡旋混匀,超声提取10min,2000xg离心5min,取3mL上清进行固相萃取,固相萃取柱为HyperSep HyperCarb 色谱柱(200mg/3mL,货号60106-301),固相萃取步骤如下:
活化:1mL 乙腈,1mL乙醇,负压过柱
上样:3mL 上清液,1mL/min速率过柱
洗脱:500μL 20%乙腈-水溶液洗脱,1mL/min
洗脱两次,合并洗脱液,直接进行LC-MS/MS分析。
二、 样品分析方法
1. 仪器
Accela HPLC;TSuantum Access MAX 三重串联四级杆质谱检测器;Hypercarb 液相色谱柱(100x2.1mm,5μm,货号35005-102130)。
2. 参数设置
液相参数:
柱温:室温
进样量:10μL
梯度:
质谱参数:
离子化模式:电喷雾电离,正离子模式;
质谱扫描方式:选择反应监测(SRM);
分辨率:单位分辨率;
毛细管温度:350℃;
雾化温度:350℃;
喷雾电压:3700V;
鞘气压力:30 arb;
辅助气流速:10 arb;
碰撞气压力:1.0 mTorr;
离子对参数见下表:
3.色谱图
见图1。
图 1 鸡肉加标样品检测结果(利巴韦林浓度,1ppb;同位素内标浓度:1ppb)
三、 结果与讨论
利巴韦林为强极性化合物,使用水作为溶剂即可将其*提取。但常规色谱柱无法将其保留。Hypersep Hypercarb是Thermo Scientific*的固相萃取填料,基质为具有平面结构的多孔石墨化碳(PGC),能与极性化合物产生偶极-偶极相互作用而使其具有强保留性质,特别适合极性化合物的纯化。
本实验中,使用HyperSep Hypercarb 进行样品的纯化,可以得到满意的回收率,在50ppb的加样回收试验中,回收率为121.8%,重现性良好。且方法简单,与现有方法相比,避免了反复调节pH值的步骤。而且,使用20%乙腈即可将目标物洗脱,避免在后继的分析过程中产生明显的溶剂效应。
在分析过程中发现,利巴韦林色谱峰附近容易出现干扰物质,根据文献判断,可能为内源性的异构体。该异构体容易使结果出现假阳性,但使用HyperCarb色谱柱,在极为简单的流动相条件下,即可实现分离。